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丙酮酸液相檢測方法
來源: | 作者:上海優(yōu)選生物 | 發(fā)布時間: 2024-08-12 | 276 次瀏覽 | 分享到:

丙酮酸是所有生物細(xì)胞糖代謝的重要中間體,它是一種酸性較弱的有機酸,分子結(jié)構(gòu)為CH3COCOOH,同時含有活化酮和羧基基團??勺鳛樵?,應(yīng)用于化學(xué)、制藥、食品、農(nóng)業(yè)、生物等領(lǐng)域。



通過乙酰CoA和三羧酸循環(huán),丙酮酸可以實現(xiàn)糖、脂肪、氨基酸之間的互相轉(zhuǎn)化。丙酮酸是糖酵解途徑的最終產(chǎn)物,在細(xì)胞漿中還原為乳酸為機體供能,或進入線粒體氧化成乙酰CoA,進入三羧酸循環(huán),被氧化成二氧化碳和水,進行葡萄糖有氧代謝。容易與氮化物、醛、鹵化物、磷化物等反應(yīng),參與生物體的糖代謝,以及膠質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)等的合成、代謝等。



檢測樣本中丙酮酸含量,主要采用高效液相色譜(HPLC)法?;静襟E包括樣品制備、色譜條件設(shè)置、標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品測定和計算。


一、樣品準(zhǔn)備


根據(jù)實驗需要,選擇適當(dāng)?shù)纳飿颖荆缂?xì)胞提取物、組織勻漿或體液等。對樣本進行必要的預(yù)處理,如離心、過濾或稀釋,以去除雜質(zhì)并調(diào)整樣本濃度。


二、色譜條件優(yōu)化


在選擇色譜柱時,需考慮丙酮酸的極性和分子量,選擇適合的色譜柱類型。同時,優(yōu)化流動相組成和流速,以獲得最佳的分離效果和檢測靈敏度。如采用氨基柱,柱溫30℃,乙腈-磷酸二氫鉀(梯度洗脫)為流動相,流速1.0ml/min,紫外檢測器,波長210nm等。



三、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線


使用純丙酮酸制備一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,通過高效液相色譜儀測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積或峰高。以丙酮酸濃度為橫坐標(biāo),峰面積或峰高為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。確保標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系,以便后續(xù)樣品中丙酮酸含量的準(zhǔn)確計算。準(zhǔn)確稱取丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品,按要求的溶劑,配制5,10,20,50,100,200ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液,根據(jù)測定的色譜峰面積,對應(yīng)濃度,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計算回歸方程和回收率。


四、樣品測定和計算


將預(yù)處理好的樣品注入高效液相色譜儀中,記錄丙酮酸的色譜峰。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品中丙酮酸的色譜峰面積,計算樣品中丙酮酸的含量。


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